Análisis de los genes implicados en la maquinaria de la replicación del DNA en Entamoeba histolytica

Abstract

"Resumen: Entamoeba histolytica es responsable de la amibiasis en humanos, que afecta hasta el 3.5% de la población mundial. Ha sido considerado un eucariota primitivo debido a la ausencia de mitocondria y por su retículo endoplásmico y aparato de Golgi atípicos. En eucariotas, la replicación del DNA inicia con el reconocimiento de la secuencia Ori por el complejo ORC, que posteriormente recluta a las helicasas MCM. Otras proteínas involucradas en la replicación en eucariotas son las DNA polimerasas, el complejo GINS, proteínas CDK, PCNA y DNA ligasas. Aunque la maquinaria de replicación está bien caracterizada en humano y levadura, se sabe poco de su conformación en E. histolytica. Es por ello que decidimos identificar in silico a la maquinaria de replicación de este parásito, mediante la base de datos de AmoebaDB, empleando como sondas las secuencias de aminoácidos de las proteínas de Homo sapiens y Schizosaccharomyces pombe involucradas en la replicación del DNA mediante la base de datos AmoebaDB. Además, se analizaron los dominios funcionales y la estructura tridimensional de las proteínas identificadas. Los resultados obtenidos mostraron que en el genoma de E. histolytica se encuentran codificadas las proteínas necesarias para la replicación de sus cromosomas; sin embargo, existen diferencias en la composición, la cual parece ser más simplificada, ya que solo codifica en su genoma 43 de las ~63 proteínas que conforman el replisoma humano. Por otro lado, analizamos los cambios de expresión de genes característicos de las diferentes etapas, empleando cultivos de trofozoítos privados de suero para sincronizar su replicación y observamos que algunos de ellos modifican su expresión de manera cíclica, sugiriendo dos eventos de duplicación en un lapso de 24 h. Finalmente, evaluamos la localización de EhPCNA, una proteína clave en la replicación del DNA, por medio de ensayos de inmunofluorescencia y observamos, durante la depleción de suero, una abundante cantidad de proteína en el núcleo de los trofozoítos en comparación con la condición basal, para posteriormente cambiar su nivel de expresión conforme transcurre el tiempo después de la adición de suero. En conclusión, en este trabajo identificamos las proteínas que podrían conformar el replisoma de E. histolytica, lo que nos permitirá comprender de una manera más completa el proceso de replicación del DNA en este parásito" Abstract Entamoeba histolytica is the causative agent of human amebiasis, affecting up to 3.5% of the global population. It is considered a primitive eukaryote due to the absence of mitochondria and the presence of atypical endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. In eukaryotes, DNA replication initiates by the recognition of the origin (Ori) sequence by the origin recognition complex (ORC), followed by the recruitment of MCM helicases. Other essential components of the replication machinery include DNA polymerases, the GINS complex, CDKs, PCNA, and DNA ligases. While the replication machinery has been well characterized in humans and yeast, its composition in E. histolytica remains poorly understood. Therefore, in this study, we performed an in silico identification of DNA replication-related proteins in E. histolytica using amino acid sequences from Homo sapiens and Schizosaccharomyces pombe as queries in the AmoebaDB database. We also analyzed the functional domains and predicted three-dimensional structures of the identified proteins. Our results indicate that the E. histolytica genome encodes homologs of key proteins involved in chromosomal replication. However, notable differences were observed: the E. histolytica replisome appears to be simplified, encoding only 43 proteins compared to the approximately 63 components of the human replisome. Furthermore, we analyzed gene expression of several replication-associated genes in normal conditions cultured-trophozoites and subjected to serum deprivation to synchronize replication. The expression of these genes followed a cyclic pattern, suggesting two rounds of DNA replication occur within a 24-hour period. Finally, we assessed the localization of PCNA—a key replication marker—via immunofluorescence. We observed increased nuclear accumulation of PCNA in trophozoites under serum deprivation, with changes in localization following serum replenish. In conclusion, our study identifies putative components of the E. histolytica replisome and provides insights into the DNA replication dynamics of this parasite, laying the groundwork for further functional characterization.