“IDENTIFICACIÓN DE CUATRO DNA POLIMERASAS DE TIPO ORGANELAR EN Entamoeba histolytica. LOCALIZACIÓN DEL GEN Ehodp1 Y DE LA PROTEÍNA EhODP1”

Abstract

"RESUMEN Entamoeba histolytica es un eucarionte que posee organelos citoplásmicos conocidos como EhkOs, los cuales presentan una doble membrana y contienen DNA. Este DNA ha sido detectado con naranja de acridina, ioduro de propidio y mediante marcaje con timidina tritiada. En los EhkOs se ha identificado a la enzima EhPFO y a los factores de transcripción EhTBP, EhC/EBP y Ehp53. Actualmente no se conoce ni el origen ni la función de este organelo en este protozoario, por lo cual, para abordar el estudio de los mismos, hemos trabajado en su purificación y, dado que los EhkOs contienen DNA, nos dimos a la tarea de buscar una DNA polimerasa que pudiera estar relacionada con estos organelos. La replicación del DNA de todos los seres vivos se lleva a cabo por medio de DNA polimerasas, las cuales pueden variar en su composición de polipéptidos y propiedades catalíticas (procesividad, fidelidad y tasa de extensión de la cadena). Las DNA polimerasas se agrupan en diferentes familias con base en la similitud de sus secuencias. La familia B se caracteriza por la presencia de hasta seis regiones conservadas (I a VI) e incluye a las polimerasas replicativas tipo α de eucariontes, las de arqueobacterias, las virales, las de bacteriófagos (como T4 y RB69) y las DNA polimerasas codificadas en plásmidos mitocondriales de varios hongos y plantas. La maquinaria de replicación en E. histolytica es poco conocida. Investigaciones concernientes al tipo de DNA polimerasas existentes en este parásito revelaron que su actividad es inhibida con afidicolina, un inhibidor específico de las DNA polimerasas de mamífero α, δ y ε, todas ellas pertenecientes a la familia B. Como resultado de la búsqueda de probables DNA polimerasas relacionadas con organelos mitocondriales en E. histolytica, en el presente trabajo identificamos una familia de cuatro genes de DNA polimerasas (Ehodp1, Ehodp2, Ehodp3 y Ehodp4) que tienen similitud con DNA polimerasas codificadas en plásmidos mitocondriales de hongos y plantas. Por medio de RT-PCR observamos que los cuatro genes se expresan en los trofozoítos de manera diferencial. El análisis de las secuencias de las proteínas codificadas por los cuatro genes reveló que todas conservan los dominios catalíticos y las secuencias características que las clasifican como DNA polimerasas de la familia B. También clonamos un fragmento del gen Ehodp1 y lo expresamos en E. coli BL21(DE3) para producir la proteína recombinante (rEhODP1-168), la cual purificamos mediante cromatografía de afinidad. Con esta proteína inmunizamos ratas y obtuvimos anticuerpos específicos contra EhODP1. Por medio de inmunofluorescencia y microscopía confocal utilizando estos anticuerpos localizamos a la proteína EhODP1 en los EhkOs lo cual sugiere que EhODP1 puede estar relacionada con la replicación del DNA de EhkO. Por otro lado, empleando la técnica de PCR in situ se determinó la ubicación del gen en los trofozoítos y lo encontramos tanto en el núcleo como en el EhkO, lo cual nos indicó que podría existir una estrecha relación entre estos organelos. Con el presente trabajo se generó el primer reporte acerca de la existencia de este tipo de DNA polimerasas en E. histolytica, cuyo estudio contribuirá al conocimiento de la biología y la evolución de este importante patógeno humano". ABSTRACT Entamoeba histolytica is a eukaryote that has the cytoplasmic organelles known as EhkOs. These organelles have a double membrane and contain DNA, which has been detected using acridine orange and propidium iodide staining, and also by 3H-tymidine labeling. In addition, the EhPFO enzyme and EhTBP, EhC/EBP and Ehp53 transcription factors have been detected in these organelles. However, origin and function of this organelle remain unknown. If EhkOs have DNA, then there might be a DNA polymerase involved in their DNA replication. Therefore, we performed a search for a putative DNA polymerase that could be related to these organelles. DNA replication in living cells is carried out by DNA polymerases, which can have differences in number of polypeptides and catalytic properties such as processivity, fidelity and DNA chain extension rates. DNA polymerases are grouped in several families based on sequence similarity. Family B is characterized by the presence of up to six conserved regions (I to VI). It includes replicative DNA polymerases of α type from eukaryotes, those from archaebacteria, some viral DNA polymerases, from bacteriophages (such as T4 and RB69 DNA polymerases), and DNA polymerases encoded in mitochondrial plasmids in some fungi and plants. The E. histolytica replication machinery is poorly studied. Some research groups have found that the DNA polymerase activity is blocked by aphidicolin, a specific inhibitor of mammalian α, δ and ε DNA polymerases belonging to family B. In this work we report the identification of a family of four active genes (Ehodp1, Ehodp2, Ehodp3, and Ehodp4) encoding putative DNA polymerases in E. histolytica, which showed similarity to DNA polymerases encoded in fungi and plant mitochondrial plasmids. We determined by RT-PCR that the four genes are differentially expressed in trophozoites. Sequence analysis of proteins encoded by the four genes revealed that all conserve the catalytic domain and the characteristic sequences that allowed to classify them as DNA polymerases of family B. We also cloned and expressed a fragment of the Ehodp1 gene in E. coli BL21(DE3) to produce the recombinant rEhODP1-168 polypeptide purified by affinity chromatography. This recombinant protein was used to immunize rats in order to obtain EhODP1 specific polyclonal antibodies. Anti-rEhODP1 antibodies were used for the immunolocalization of EhODP1 in EhkOs by immunofluorescence and confocal microscopy. We also determined by in situ PCR the localization of the Ehodp1 in nuclei and EhkOs, which suggests a relationship between these two organelles. From the present work, we generated the first report about this type of DNA polymerases in E. histolytica. The study of these molecules will contribute to the better understanding of the biology and evolution of this human pathogen".