Identificación de microRNAs modulados durante la metástasis de tumores de cáncer de mama que desarrollaron mimetismo vasculogénico

Abstract

"Resumen El cáncer de mama triple negativo (CMTN) es el subtipo más agresivo y de peor pronóstico. Se ha descrito que los pacientes con tumores con CMTN presentan una mayor probabilidad de desarrollar metástasis y mimetismo vasculogénico (MV). Diversos estudios sobre los OMICS han revelado la importancia de los microRNAs (miRNAs) en diferentes procesos biológicos de la célula, incluido el cáncer, un ejemplo de ello es el supresor de tumores miR-204 que en CMTN se reportó que inhibe el MV a través de la inhibición de la expresión y fosforilación de proteínas implicadas en las vías de señalización de PI3K/AKT, RAF1/MAPK, VEGF y FAK/SRC. El desarrollo de este trabajo de investigación se realizó en dos etapas. A través de un análisis bioinformático de un perfil de expresión de miRNAs obtenido de datos públicos se seleccionaron un set de miRNAs en pacientes de CMTN. De este análisis se identificaron 26 miRNAs sobreexpresados en tumores con metástasis con respecto con los que no desarrollaron metástasis. Mediante análisis de predicción se identificaron que estos miRNAs tienen diferentes RNAm blancos que participan en el MV y la tales como VEGF, HIF, MMP, SMAD2, ZEB1/2 entre otros, los cuales se han descrito que promueven el desarrollo del MV o se encuentran asociados a la angiogénesis, el MV y la metástasis. Posteriormente, se corroboró la posible interacción de estos 26 miRNAs con sus blancos mediante un análisis de interacción de redes usando la herramienta miRNET. Las redes de interacción respaldan que posiblemente estos miRNAs pudieran estar participando en el desarrollo de la metástasis y el MV a través de la modulación de la expresión de sus transcritos blancos. En la segunda etapa del desarrollo de este trabajo, se estudió un grupo de 10 miRNAs totalmente diferente al análisis bioinformático para determinar si estos tenían un papel en el MV y metástasis en pacientes mexicanas con CMTN. Se investigó la participación de los miRNAs en pacientes mexicanas con CNTN: 4 pacientes con metástasis y 6 pacientes sin metástasis. Posteriormente, para identificar la presencia de MV en los tejidos tumorales se realizaron tinciones dobles de CD31/PAS por inmunohistoquímica. Se obtuvieron los siguientes resultados: se detectaron estructuras vasculares formadas por las células tumorales con CD31- /PAS+ lo que incida que son MV+ y con presencia de eritrocitos en su interior, lo que sugiere el transporte de sangre hacia las células tumorales. Se identificaron también estructuras típicas del MV en mayor proporción en tejidos tumorales de mama de pacientes que desarrollaron metástasis en comparación con las pacientes que no desarrollaron metástasis. Se analizó la expresión de 10 miRNAs en las poblaciones antes mencionadas. En los tumores que desarrollan metástasis se observó un bajo nivel de expresión de 5 miRNAs: miR-142-3p, miR-31, miR-148a, miR-200b, miR-145 con respecto a los no metastásico. Mientras que el miR-125b y miR-9* se detectaron con una sobreexpresión en tejidos metastásicos. Sin embargo, el miR-526b, miR-126 y miR-29b no mostraron cambios significativos en sus niveles de expresión en ambos grupos de estudio. La desregulación de estos miRNAs (miR-142-3p, miR-31, miR- 148a, miR-200b, miR-145 miR-125b y miR-9*) podría indicar que están participando en promover el desarrollo del MV en las pacientes que presentaron metástasis, mediante la modulación de la expresión de sus transcritos blancos, impactando en diversas vías de señalización que dan origen al MV y metástasis. En conclusión, del análisis in silico se identificaron 26 miRNAs sobreexpresados en pacientes con CMTN. En el análisis in vitro se identificaron a 5 miRNAs con bajos niveles de expresión que promueven el MV a través de la desregulación de los blancos en pacientes con metástasis. Mientras que dos miRNAs se encuentraron sobreexpresados en este mismo grupo en comparación en tejidos no metastásicos. Por lo tanto, nuestros resultados indican que este conjunto de miRNAs potencialmente están siendo modulados en la metástasis en tumores de CMTN que desarrollaron mimetismo vasculogénico. Abstract Triple negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive subtype with the worst prognosis. It has been described that patient with tumors with TNBC have a higher probability of developing metastases and vasculogenic mimicry (VM). Various studies on OMICS have revealed the importance of microRNAs (miRNAs) in different biological processes of the cell, including cancer, one example of this is miR-204, which in CMTN was reported to inhibit MV through the inhibition of the expression and phosphorylation of proteins involved in the PI3K/AKT, RAF1/MAPK, VEGF and FAK/SRC signaling pathways. The development of this research work was carried out in two stages. Through a bioinformatic analysis of a miRNAs expression profile obtained from public data, a set of miRNAs in CMTN patients are selected. From this analysis, 26 miRNAs were identified that are overexpressed in tumors with metastases relative to those that do not develop metastases. Through prediction analysis, it was identified that these miRNAs have different target mRNAs such as VEGF, HIF, MMP, SMAD2, ZEB1/2, among others, which have been described as promoting MV development or associated with metastasis. Subsequently, the possible interaction of these 26 miRNAs with their targets was confirmed by network interaction analysis using the miRNET tool. The interaction networks support that these miRNAs could possibly be participating in the development of metastasis and MV through the modulation of the expression of their targets. In the second stage of the development of this work, a group of 10 totally different miRNAs was proposed for bioinformatic analysis to determine if they have a role in MV and metastasis in Mexican patients with CMTN. The participation of miRNAs in Mexican patients with CNTN was investigated: 4 patients with metastasis and 6 without metastasis. Subsequently, to identify the presence of MV in tumor tissues, double CD31/PAS staining was performed by immunohistochemistry. The following results were obtained: vascular structures formed by tumor cells with CD31-/PAS+ were detected, which indicates that they are MV+ and with the presence of erythrocytes inside, which suggests the transport of blood towards the tumor cells. MV structures were identified in a higher proportion in tissues from patients who developed metastases compared to patients who did not develop metastases. The expression of 10 miRNAs in the aforementioned populations was analyzed. In tumors that develop metastasis, a low level of expression of 5 miRNAs was demonstrated: miR-142-3p, miR-31, miR-148a, miR-200b, miR-145 with respect to non-metastatic tumors. While the miRNAs: miR-125b and miR-9* are detected with overexpression in metastatic tissues. However, the miRNAs: miR-526b, miR-126 and miR-29b did not show significant changes in their expression levels in both study groups. The deregulation of these miRNAs (miR-142-3p, miR-31, miR-148a, miR-200b, miR-145, miR-125b and miR-9*) could indicate that they are participating in promoting the development of MV in patients that metastasis appeared, by modulating the expression of its white transcripts, impacting on various signaling pathways that give rise to MV and metastasis. In conclusion, 26 overexpressed miRNAs in TNBC patients were identified from in silico analysis. In vitro analysis identified 5 miRNAs with low expression levels that promote MV through target deregulation in patients with metastasis. While two are found to be overexpressed in this same group compared to non-metastatic tissues. Therefore, our results indicate that this set of studied miRNAs are potentially being modulated in metastasis in TNBC tumors that develop vasculogenic mimicry.