“Identificación de las proteínas que interaccionan con la proteína BmVDAC durante la infección de Rhipicephalus microplus con Babesia bigemina”

Abstract

Resumen La babesiosis bovina es una enfermedad de alto impacto económico. Esta enfermedad es causada por parásitos del género Babesia que son transmitidos por garrapatas principalmente Rhiphicephalus microplus en México. Babesia bigemina desarrolla un complejo ciclo de vida con una fase de reproducción asexual en el hospedero bovino y sexual en la garrapata vector. El intestino de la garrapata es la primera barrera que tiene que cruzar el parásito para establecer la infección, por lo que el estudio de las proteínas involucradas en la interacción parásito/vector en esta etapa de la infección, resulta de gran interés para comprender mejor los mecanismos de invasión del parásito al intestino y para la identificación de posibles candidatos vacunales. En nuestro grupo de trabajo se identificó una proteína mitoncondrial, Canal de Aniones Dependiente de Voltage (VDAC), de los intestinos de R. microplus que interacciona con fases sexuales de B. bigemina y que se sobre expresa a las 24 h post repleción en garrapatas infectadas, sin embargo se desconoce la función que juega esta proteína. Una estrategia experimental que se utiliza actualmente para comprender la función de las proteínas, es el estudio de la interacción de la proteína sujeta de estudio con otras proteínas, por lo que el objetivo de la presente investigación fue determinar la interacción de la proteína BmVDAC con proteínas en el intestino del vector R. microplus durante el proceso de infección con B. bigemina. Para cumplir con lo anterior se infestó con larvas de R. microplus dos bovinos, uno infectado con B. bigemina y otro son infectar, a los 21 días se colectaron las garrapatas adultas repletas; los intestinos de las garrapatas fueron disectados a 0, 24, 48 y 72 h post repleción. Las proteínas de membrana de los intestinos fueron extraídas, cuantificadas y sometidas a tratamiento con el entrecruzador DSP, posteriormente se realizó la inmunoprecipitación. El extracto de intestinos de cada condición experimental se incubó con 4 μL de suero bovino preinmune o inmune anti-BmVDAC durante 16 h a 4°C en agitación, posteriormente los complejos se incubaron con 100 μL de proteína G agarosa durante 2 h a 4°C. Los complejos resultantes se corrieron en geles SDS/PAGE al 10%. Las bandas proteicas diferenciales de Peso Molecular aproximado de 50 kDa y las de la región de 90 a 140 kDa, se mandaron a analizar por espectrometría de masas. El análisis semicuantitativo evidenció una abundancia estadísticamente superior de estas bandas a las 72 h post repleción. Los péptidos identificados por espectrometría de masas correspondieron fundamentelmente a cuatro proteínas de Bos taurus: Inhibidor de la alfa-tripsina cadena pesada H4, Plasminógeno, Factor de complemento H y Fosfatidilinositol-glucano-fosfolipasa D, finalmente se verificó la interacción de BmVDAC con el plasminógeno por ensayos de binding blot. La interacción de BmVDAC con el plasminógeno bovino sugiere una de las funciones de BmVDAC, ya que esta interacción podría activar el plasminógeno a plasmina y esta degradar componentes de la matriz extracelular lo que facilitaría la invasión del parásito al intestino. Este es el primer reporte de proteínas que interaccionan con BmVDAC durante la infección de R. microplus con B. bigemina. Abstract Bovine babesiosis is a disease of high economic impact. This disease is caused by parasites of the genus Babesia that are transmitted by ticks mainly Rhiphicephalus microplus in Mexico. Babesia bigemina develops a complex life cycle with an asexual reproduction phase in the bovine and sexual in the vector tick. The midgut tick is the first barrier that the parasite has to cross to establish the infection, therefore the study of the proteins involved in the parasite / vector interaction at this stage of the infection, is of great interest to better understand the mechanisms of invasion of the parasite to the midgut and to identify of possible vaccine candidates. In our working group, a mitochondrial protein, Voltage Dependent Anion Channel (VDAC), was identified from the R. microplus midgut that interacts with B. bigemina sexual stages and it is over expressed at 24 h post repletion in infected ticks, however the role of this protein is unknown. An experimental strategy that is currently used to understand the function of proteins is the study of the interaction of the protein under study with other proteins, therefore the main goal of the present research was to determine the interaction of BmVDAC with other proteins in R. microplus midgut during the infection process with B. bigemina. Two bovines were infested with R. microplus larvae, one of them was infected with B. bigemina and the other one was uninfected. 21 days later adult ticks were collected. The tick midguts were dissected at 0, 24, 48 and 72 h post repletion. The midgut membrane proteins were extracted, quantified and subjected to treatment with the DSP crosslinker, subsequently immunoprecipitation was performed. 100 μg of protein extract of each experimental condition was incubated with 4 μL of pre-immune or immune bovine serum anti-BmVDAC for 16 h at 4 ° C, the complexes were then incubated with 100 μL of G agarose protein for 2 h at 4 ° C. The resulting complexes were run on 10% SDS / PAGE gels. Differential protein bands of Molecular Weight of approximately 50 kDa and those in the region of 90 to 140 kDa were sent to be analyzed by mass spectrometry. The semi-quantitative analysis showed a statistically superior abundance of these bands in samples from infected ticks at 72 h post repletion. The peptides identified by mass spectrometry corresponded mainly to four Bos taurus proteins: H4 heavy chain alpha-trypsin inhibitor, Plasminogen, Complement factor H and Phosphatidylinositol-glucanphospholipase D; finally the interaction of BmVDAC with the plasminogen was verified by binding blot assays. The interaction of BmVDAC with bovine plasminogen suggests one of the functions of BmVDAC, since this interaction could activate plasminogen to plasmin that degrades components of the extracellular matrix, which could facilitate the invasion of the parasite into the midgut. This is the first report of proteins that interact with BmVDAC during the infection of R. microplus with B. bigemina.