Análisis del interactoma de EhMyb10: Evidencias de su papel como factor pionero en el parásito Entamoeba histolytica

Abstract

"Resumen Entamoeba histolytica es el agente causal de la amebiasis, una enfermedad que afecta a millones de personas en el mundo. Su capacidad de adaptación, colonización e invasión tisular depende de mecanismos de regulación transcripcional que involucran factores de transcripción (FT) y proteínas modificadoras de cromatina, algunos de los cuales han sido caracterizados. En este trabajo se analizó al FT EhMyb10, miembro de la familia EhMybR2R3, cuyo dominio de unión al DNA (DBD) presenta similitud estructural con el del FT pionero c-Myb humano. Los factores pioneros se caracterizan por su capacidad de unirse a cromatina compacta y promover estados transcripcionalmente activos mediante el reclutamiento de proteínas remodeladoras y modificadoras de histonas. Para evaluar el posible papel de EhMyb10 como FT pionero, se generaron trofozoítos que sobreexpresan de manera estable a esta proteína fusionada a una etiqueta HA (EhMyb10ox). La sobreexpresión fue confirmada mediante RT-qPCR y Western blot, observándose una localización predominantemente nuclear por inmunofluorescencia. Ensayos de inmunoprecipitación seguidos de espectrometría de masas identificaron 32 proteínas candidatas a interactuar con EhMyb10, incluyendo proteínas relacionadas con vías de señalización celular, como proteínas Ras/cinasas y la lectina Gal/GalNAc, lo que sugiere que EhMyb10 podría participar también en procesos de señalización asociados con adaptación y virulencia del parásito. Además, la sobreexpresión de EhMyb10 incrementó la abundancia de EhMAT1A y de la metiltransferasa EhPKMT2, así como el patrón global de proteínas dimetiladas en lisina. Mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión se observó que EhMyb10 colocaliza con EhMAT1A, EhPKMT2 y con marcas epigenéticas asociadas a enhancers activos (H3K4me1 y H3K27ac), así como con marcas relacionadas con activación (H4K12ac) y represión transcripcional (H3K27me3). La interacción entre EhMyb10 y EhPKMT2 fue validada mediante ensayos de pull-down empleando EhMyb10 recombinante. Finalmente, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de cromatina los cuales mostraron el reclutamiento de EhMyb10 a la región promotora distal del gen ehmat1a en la condición control. La ausencia de enriquecimiento en la condición de sobreexpresión sugiere que la cromatina en este locus podría encontrarse previamente en un estado más accesible debido a la actividad de EhMyb10. En conjunto, estos hallazgos sugieren que EhMyb10 podría presentar características funcionales compatibles con un FT pionero y una participación en la regulación epigenética, transcripcional y de vías de señalización en E. histolytica. Abstract Entamoeba histolytica is the causative agent of amoebiasis, a disease affecting millions of people worldwide. Its ability to adapt, colonize, and invade host tissues depends on transcriptional regulatory mechanisms involving transcription factors (TFs) and chromatin-modifying proteins, which remain poorly characterized in this organism. In this work, the TF EhMyb10, a member of the EhMybR2R3 family, was analyzed. Its DNA-binding domain (DBD) displays high structural similarity to that of the human canonical pioneer TF c-Myb. Pioneer factors are characterized by their ability to bind compact chromatin and promote transcriptionally active states through the recruitment of chromatin-remodeling and histone-modifying proteins. To evaluate the potential role of EhMyb10 as a pioneer factor, trophozoites stably overexpressing HA-tagged EhMyb10 (EhMyb10ox) were generated. Overexpression was confirmed by RT-qPCR and Western blot analyses, and immunofluorescence assays revealed a predominantly nuclear localization. Immunoprecipitation assays followed by mass spectrometry identified 32 candidate proteins potentially interacting with EhMyb10, including proteins associated with cellular signaling pathways, such as Ras proteins/kinases and the Gal/GalNAc lectin, suggesting that EhMyb10 may also participate in signaling processes related to parasite adaptation and virulence. Furthermore, EhMyb10 overexpression increased the abundance of EhMAT1A and the methyltransferase EhPKMT2, as well as the global pattern of lysine-dimethylated proteins. Immunofluorescence and transmission electron microscopy analyses showed that EhMyb10 colocalizes with EhMAT1A, EhPKMT2, and epigenetic marks associated with active enhancers (H3K4me1 and H3K27ac), as well as marks related to transcriptional activation (H4K12ac) and transcriptional repression (H3K27me3). The interaction between EhMyb10 and EhPKMT2 was validated by pull-down assays using recombinant protein. Finally, chromatin immunoprecipitation assays revealed the recruitment of EhMyb10 to the distal promoter region of the ehmat1a gene under control conditions. The absence of enrichment in the overexpression condition suggests that chromatin at this locus may already be in a more accessible state due to prior EhMyb10 activity. Collectively, these findings suggest that EhMyb10 exhibits functional features compatible with a pioneer TF and its possible involvement in epigenetic, transcriptional, and signaling pathway regulation in E. histolytica".