Análisis de la localización intracelular de la proteína EhTRF-like II de entamoeba histolytica y sus interacciones in silico con secuencias de ADN.

Abstract

Resumen: Las proteínas TRF1 y TRF2 de humano se unen al ADN telomérico de doble cadena en los extremos terminales de los cromosomas, formando complejos ADN-proteínas que los protegen, regulan su tamaño y evitan las fusiones cromosómicas. En el genoma de Entamoeba histolytica no se han identificado secuencias teloméricas, ni está presente un gen que codifique para la enzima telomerasa, y el 10% del mismo corresponde a ARNt asociados a repeticiones en tándem (STR), localizadas en los extremos del 70 % de los cromosomas de este organismo. Por esa razón, se ha propuesto que estos arreglos pueden funcionar como secuencias teloméricas. Adicionalmente, en el genoma de E. histolytica se identificaron tres proteínas homólogas a las proteínas TRF1 y TRF2 de Homo sapiens, las cuales se denominaron EhTRF-like I, II y III. Los genes ehtrf-like I y II están contiguos en el genoma, lo cual podría ser el resultado de una duplicación. El porcentaje de identidad del dominio Myb de unión a ADN (DBD Myb) de estas proteínas con sus homólogos humanos es del 93.9%. En este dominio se identificaron los 3 motivos presentes en las proteínas homólogas humanas: N-terminal linker, parche acídico y Telebox. En este trabajo se identificaron 18 proteínas TRF-like en los géneros Entamoeba, Acanthamoeba y Naegleria, utilizando la expresión regular [V/L][D/S]L[K/R]DK[W/Y]R, la cual corresponde a la secuencia Telebox. En todos estos géneros, las proteínas ortólogas a TRF contienen en el DBD Myb los tres motivos importantes para el reconocimiento del ADN. Asimismo, se predijo que los dominios TRFH y DBD Myb de la proteína EhTRF-like II pueden modificarse postraduccionalmente, a través de fosforilaciones, SUMOilaciones y la formación de un puente disulfuro, lo que podría modificar su unión al ADN, su localización e interacción con otras proteínas. En esta tesis también se demostró mediante Docking Molecular que el complejo formado por el DBD Myb-EhTRF-like II y la secuencia derivada del STR de ARNt de E. histolytica (EhTel) tiene una mayor energía de unión y un mayor número de contactos y pseudoenlaces que el formado con la secuencia telemérica canónica (HsTel); sugiriendo que este dominio tiene una mayor afinidad por la secuencia EhTel de E. histolytica, que por la secuencia HsTel humana. Por otro lado, la proteína EhTRF-like II se inmunodetectó en la fracción nuclear insoluble de E. histolytica HMI-IMSS con un peso molecular de ~50 kDa. Finalmente, se determinó la localización nuclear de EhTRF- like II en la periferia nuclear de los trofozoítos, sugiriendo que ocupan una posición compatible con la protección de las regiones teloméricas en E. histolytica.

Abstract:

Human TRF1 and TRF2 proteins bind to double-stranded telomeric DNA at the terminal ends of chromosomes, forming DNA-protein complexes that protect and regulate their size, and prevent chromosomal fusions. In the genome of Entamoeba histolytica, neither telomeric sequences nor a gene coding for the enzyme telomerase have been identified. On the other hand, 10% of the genome corresponds to tRNA associated with short tandem repeats, some located at the ends of the chromosomes of this organism, so it has been proposed that these arrangements could act as telomeric sequences. In the genome of E. histolytica, three homologues of TRF1 y 2 proteins were identified, which were called EhTRF-like I, II y III. The genes that encode for EhTRF-like I and II are contiguous in the genome which could be the result of a duplication. These proteins contain a TRFH domain which is involved protein- protein interactions and a MYB DNA Binding Domain (MYBDBD) which recognize the telomeric sequence. The MYB DBD has three important motifs: the N-terminal linker, an acidic patch and the Telebox. In this work we search for TRF-like proteins in all Entamoeba, Acanthamoeba and Naegleria genera using the regular expression [V/L][D/S]L[K/R]DK[W/Y]R which corresponds to the Telebox sequence. We identified Myb-like proteins. In all the genera analyzed the orthologous TRF protein contain in their MYB DBD the three motifs which are important for DNA recognition. Likewise, it was predicted that the TRFH and DBD Myb domains of the EhTRF-like II protein can be post- translationally modificated, through phosphorylations, sumoylations and the formation of a disulfide bridge, which could modify its binding to ADN, its location and interaction with other proteins. We analyzed the binding of the DBD-EhTRF-like II with different DNA sequences obtained from de canonical telomeric sequence (HsTel) and the Entamoeba STRs (EhTel) using Molecular Docking. Our data showed that the EhTel sequence has higher binding energy and a greater number of contacts and pseudo-bonds than with HsTel sequence, suggesting that this domain has a greater affinity for the sequence derived from the STR of de E. histolytica rRNA array, than the canonical telomeric sequence. In this work, we analyzed the localization of EhMybTRF-like II protein in the E. histolytica trophozoites though western blot and immunofluorescence assays. The EhTRF-like II was detected in the insoluble nuclear extracts in a 50 kDa band and was located in the nuclear periphery of the trophozoites of E. histolytica. This location is as expected for proteins related to the telomeric function.