Caracterización estructural y funcional de la proteína Tv-PSP1 de Trichomonas vaginalis

Abstract

Resumen:

Los miembros de la familia de proteínas YER057c / YjgF / UK114 (Proteína soluble en ácido perclórico PSP) son macromoléculas con estructura homotrimérica que tienen 6 - 9 aminoácidos conservados en el sitio catalítico, poseen diversas funciones: 1) participan en la desaminación hidrolítica de intermedios de enamina / imina formados en el metabolismo de los aminoácidos, y 2) pueden funcionar como endoribonucleasas. Estas proteínas se encuentran presentes en los diversos dominios de la vida, desde las bacterias hasta los vertebrados. Dentro del genoma de Trichomonas vaginalis, un parásito protozoario causante de la tricomoniasis, se localizan 3 genes (tv-psp1, tv-psp-2 y tv-psp3) que codifican para las proteínas Tv- PSP1, Tv-PSP2 y Tv-PSP3. El objetivo de este trabajo fue determinar la importancia de los puentes disulfuro en la estabilidad estructural de la proteína Tv-PSP1 y probar su función catalítica en presencia y ausencia de cloro con el enlace disulfuro formado. Se obtuvieron in silico dos proteínas Tv-PSP1 mutantes para la posición 76, los aminoácidos fueron seleccionados a partir de un alineamiento de proteínas L-PSP de diversos organismos. A través de dinámica molecular se logró obtener el radio de giro y el RMSD de Tv- PSP, tanto de la proteína WT como de ambas mutantes, mostrando un movimiento diferencial de uno de los monómeros de Tv-PSP1 WT con respecto a los otros dos monómeros a lo largo de 1000 ns. El radio de giro y RMSD de las mutantes de Tv- PSP1 no mostraron cambios significativos en la estructura tridimensional sugiriendo que los enlaces disulfuro no participan en el mantenimiento de su estructura tridimensional. Para validar experimentalmente los hallazgos encontrados in silico, se obtuvo la proteína Tv-PSP-1 WT recombinante con etiqueta de histidinas a partir de la clonación de tv-psp1 en el vector de expresión pET28 a+. Las proteínas recombinantes se expresaron en cepas BL21 y Rosetta gami de E. coli, posteriormente fueron purificadas por FPLC y se identificaron por Western Blot usando los anticuerpos α-Tv-PSP1 y α- His-TAG. Se realizaron ensayos funcionales con rTv-PSP1 clorada y no clorada con presencia de enlaces disulfuro. Los resultados mostraron que rTv-PSP1 WT degrada parcialmente el RNA total de T. vaginalis, no así cuando se eliminó la presencia de cloro mediante purificación en columna. La proteína r Tv-PSP1 WT sin cloración y con presencia de los enlaces disulfuro no fue capaz de degradar al RNA.

Abstract:

The members of the protein family YER057c / YjgF / UK114 (Protein soluble in perchloric acid PSP) are macromolecules with homotrimeric structure that have 6 - 9 amino acids conserved in the catalytic site, with various functions: 1) involved in the hydrolytic deamination of intermediates of enamine / imine formed in amino acid metabolism, and 2) they can function as endoribonucleases. These proteins are present in the various domains of life, from bacteria to vertebrates. Within the genome of Trichomonas vaginalis, a protozoan parasite that causes trichomoniasis, 3 genes are located (tv-psp1, tv-psp-2 and tv-psp3) that code for the proteins Tv-PSP1, Tv- PSP2 and Tv-PSP3. The aim of this work was to determine the relevance of the disulfide bridges in the structural stability of the Tv-PSP1 and to analyze its catalytic function in the chlorine presence or absence with the disulfide bond formed. By in silico analysis, were obtained two Tv-PSP1 mutants in the position 76. The screening of the amino acids mutants was doing by an alignment of L-PSP of several organisms. By Molecular Dynamics, we obtained the radius of gyration and the RMSD of the Tv- PSP1, WT and the two mutants, this analysis shown a differential movement of one of the Tv-PSP1 WT monomers in comparison with the other two monomers to the 1000 ns. The Tv-PSP1 mutants did not show significant changes in the three-dimensional structure. These results suggested that the disulfide bonds do not participate in the maintenance of their three-dimensional structure. To validate the results obtained in silico, we obtained the Tv-PSP1 recombinant with histidine-tagged, for this, we cloned de tv-psp1 insert in the expression vector pET28 a + and the rTv-PSP1 was expressed in E. coli BL21 and Rosetta gami strains, then, they were purified by FPLC and identified the Tv-PSP1 by Western Blot using the α-Tv- PSP1 and α-His-TAG antibodies. Functional analysis was performed with chlorinated and non-chlorinated rTv-PSP1 with the presence of disulfide bonds. The results shown that only the Tv-PSP1 WT degraded the total RNA of T. vaginalis. The chlorine presence was eliminated by the columna purification and the Tv-PSP1 was not able to degrade RNA.