Caracterización proteómica de la proteína VDAC de Rhipicephalus microplus durante la infección con Babesia bigemina.

Abstract

Resumen "Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados capaces de causar daños severos a su hospedero y de transmitir múltiples patógenos. En México, Rhipicephalus microplus es una de las garrapatas con mayor importancia para la salud animal en el área de la ganadería. R. microplus parasita principalmente a bovinos y es el vector de múltiples patógenos como Babesia bigemina, un parásito protozoario del phylum Apicomplexa. Esta garrapata y los patógenos que transmite causan pérdidas millonarias a la industria ganadera mexicana. Una estrategia de control integral de garrapatas ha sido implementada en México para disminuir el impacto económico causado por R. microplus. El canal de aniones dependiente de voltaje de R. microplus (BmVDAC) es una proteína que se encuentra altamente conservada entre múltiples especies y cepas de garrapatas, es inmunogénica en bovinos y disminuye la viabilidad de las garrapatas que se alimentan de bovinos inmunizados. Estas características hacen que BmVDAC sea considerado como un candidato vacunal prometedor. Trabajos anteriores de nuestro grupo de trabajo han demostrado que, durante la infección con B. bigemina, BmVDAC se sobreexpresa y se relocaliza en células intestinales de R. microplus. Además, se ha demostrado que BmVDAC interactúa con el plasminógeno bovino cuando la proteína es purificada de muestras de intestinos de garrapata infectados con B. bigemina a 72 horas post repleción. Por otra parte, en trabajos anteriores se ha observado que un anticuerpo específico anti-BmVDAC reconoce más de un spot con el mismo peso molecular pero diferente punto isoeléctrico a las 72h post-repleción, en garrapatas infectadas con B. bigemina, lo que podrían representar diferentes isoformas de la proteína que se expresan diferencialmente como consecuencia de la infección. El objetivo del presente trabajo fue identificar las isoformas de BmVDAC que R. microplus expresa durante la infección con B. bigemina. Mediante análisis bioinformático se buscó descartar la presencia de múltiples copias del gen que codifica para BmVDAC y predecir las posibles modificaciones postraduccionales de la proteína. Los resultados obtenidos indican que no existen múltiples copias del gen de Bmvdac en el genoma de R. microplus. Además, doce residuos únicos susceptibles a acetilaciones y fosforilaciones presentes en regiones no transmembranales y pockets moleculares fueron predichos. A nivel experimental se realizaron ensayos de inmunodetección en una membrana de nitrocelulosa de proteínas separadas mediante 2D- PAGE, con el anticuerpo específico anti-BmVDAC, utilizando extractos de intestinos de garrapatas infectadas y no infectadas a 0, 24 y 48 h postrepleción; los resultados mostraron un solo spot. Para determinar la posible función de las posibles modificaciones postraduccionales de BmVDAC realizamos un docking proteína-proteína entre BmVDAC y el plasminógeno bovino usando dos programas diferentes. Esta interacción ya se había demostrado experimentalmente con anterioridad en nuestro grupo. Las predicciones de interacción entre BmVDAC y el plasminógeno bovino indicaron que los complejos formados por estas dos proteínas son más estables cuando BmVDAC se encuentra fosforilada. Estos resultados sugieren que la interacción de BmVDAC con el plasminógeno se encuentra regulada por las modificaciones postraduccionales de BmVDAC expresadas durante la infección con B. bigemina.

Abstract

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites capable of gravely harm its host and transmit several pathogens. In Mexico, Rhipicephalus microplus is one of the most relevant ticks in the field of veterinary healthcare and livestock industry. R. microplus mainly feeds on cattle and its vector to diverse pathogens such as B. bigemina, an apicomplexan protozoa parasite. This tick and its borne pathogens are the reason for millionaire loses to the Mexican livestock industry. An integrated tick control strategy was implemented in Mexico to diminish the economical and health impact caused by R. microplus infestations. A promising novel vaccine candidate is the R. microplus voltage-dependent anion channel (BmVDAC). This is a highly conserved protein between multiple tick species and strains, its immunogenic in cattle and decreases viability of ticks fed on immunized cattle. Previous projects of our workgroup have demonstrated that, during B. bigemina infection, BmVDAC is upregulated and relocalized in R. microplus midgut cells. It has been demonstrated that BmVDAC interacts with the bovine plasminogen when it is extracted from B. bigemina-infected midgut cells at a 72-hour post-repletion time. Additionally, results of previous projects indicate that an anti-BmVDAC specific antibody recognizes multiple spots with equal molecular weight but different isoelectric point at a 72-hour post-repletion time, in total protein extract of B. bigemina-infected midgut cells. These results suggest that multiple BmVDAC isoforms could be expressed because of the infection. This project’s objective was to identify the BmVDAC isoforms expressed in R. microplus midgut cells during the B. bigemina infection. By conducting a series of bioinformatic analyses we sought to rule out the possibility of multiple copies of the Bmvdac gene being coded in R. microplus genome and to predict the possible post-translational modifications of the protein. Results rule out the existence of multiple copies of the Bmvdac in the R. microplus genome. Additionally, twelve unique amino acid residues susceptible to phosphorylationand acetylation located at non-transmembrane protein regions and molecular pockets were predicted. At an experimental level, we performed 2D Western-Blot assays with an anti- BmVDAC-specific antibody, using total protein extracts from B. bigemina-infected R. microplus midgut samples at post-repletion times of 0, 24 and 48 h; results showed one single spot. we performed more in-depth in silico analyses to determine the possible role of the predicted residue phosphorylations. For this reason, we performed protein-protein docking predictions between BmVDAC and the bovine plasminogen using two different programs. This interaction was previously experimentally confirmed in a previous project of our workgroup. Docking prediction indicated that the BmVDAC and bovine plasminogen complexes are more stable when BmVDAC is phosphorylated. These results suggest that the interaction between BmVDAC and the bovine plasminogen is regulated by BmVDAC post-translational modifications expressed during B. bigemina infections".